最近，经常有同学向小尚反馈细胞复苏不理想。细胞复苏作为细胞培养中的常规操作，其实涉及许多容易被忽视的细节，其成功与否与冻存与复苏操作密切相关，稍有不慎就可能导致无法挽回的后果。本文将重点分析冻存过程中的关键步骤，下一周将更新复苏操作中的问题排查，欢迎同学们收藏关注。

首先，让我们回顾一下冻存步骤：

1. 提前准备好冻存液。
2. 离心获取细胞沉淀后，加入冻存液轻轻重悬细胞。
3. 将细胞悬液转移至冻存管。
4. 如使用程序冻存液，则需将冻存管放入程序冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜后液氮保存；如使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

以下是冻存过程中常见的错误操作：

1. 使用常规冻存液时未采取恰当的保温措施

在使用含有血清的常规冻存液（培养基 + 血清 + DMSO）时，如果没有使用程序降温冻存盒或泡沫盒进行保温，降温过快将形成冰晶，从而导致细胞破裂死亡。此外，市售的程序冻存盒可以确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。对于没有冻存盒的同学，建议将冻存管放在泡沫盒中，先在4℃下静置5-10分钟，再转入-20℃静置2小时后再放入-80℃冰箱过夜，再转入液氮保存。若实在没有冻存盒或泡沫盒，可以使用无血清非程序冻存液，因其含有更多的保护剂，可以直接重悬细胞然后放入-80℃冰箱过夜，最后转入液氮。

2. 冻存前细胞状态不佳或冻存密度过低

细胞状态良好是复苏成功的前提。应选择对数生长期、汇合度超过80%的细胞进行冻存。如果冻存前细胞培养上清呈橘黄色，建议更换培养液后静置培养4小时再进行冻存。因为在冷冻过程中，尽管冻存液中含有保护剂，仍会有少量细胞死亡，因此冻存时的细胞密度应保持在200-300万/mL/管为宜。如果不方便计数，建议一个T25瓶可冻存1-2管，一个10cm皿可冻存2-3管（注意需保持80%以上的汇合度）。

3. 直接将DMSO加入细胞悬液

有些同学直接将DMSO加入细胞悬液而未提前配制冻存液。需注意，DMSO在稀释时会释放热量，可能对较脆弱的细胞造成损伤。虽然好养的细胞影响可能不大，但为了确保实验顺利，建议先配好冻存液，再进行细胞处理。

4. 未经过-80℃冰箱直接放入液氮

将重悬细胞的冻存液直接放入液氮，因液氮温度为-196℃，未经过逐渐降温，细胞会立即死亡。应避免将细胞直接置于液氮的罐口降温。

5. 冻存液配方不合适

研究表明，5%-10%的DMSO最适合细胞冻存，具体比例需根据细胞种类调整。对于对DMSO敏感的细胞，需降低比例。根据小尚的经验，8%的DMSO适用于大部分细胞系。同时，还需根据细胞培养难度调整血清比例，越难饲养的细胞越需添加更多血清。对于过于脆弱的细胞，可以采用血清 + DMSO冻存，而不加培养基。无论使用何种冻存液，均建议进行冻检，以确认细胞状态正常后再进行大规模冻存。在冻检成功前，至少应保留一瓶细胞培养，以免复苏失败导致细胞绝灭。

6. 冻存条件不当或冻存时间过长

液氮的储存时限与稳定性优于-80℃冰箱。由于-80℃冰箱经常开关门，温度不够稳定，可能导致细胞活率快速下降。因此，最好使用液氮保存细胞。如果没有液氮罐的同学，可以将冻存管放在-80℃冰箱靠里面的位置，并定期复苏检测活性。

尊龙凯时希望以上信息能帮助大家更好地进行细胞冻存，确保实验的顺利进行，祝大家在科研道路上取得更大的成功！